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農(nóng)藥殘留與農(nóng)產(chǎn)品安全

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第一章  緒論

一、農(nóng)藥殘留與毒性
1 農(nóng)藥：用于預防、消滅或者控制為害農(nóng)業(yè)、林業(yè)的病、蟲、草和其他有害生物以及有目的地調(diào)節(jié)、控制、影響植物和有害生物代謝、生長、發(fā)育、繁殖過程的化學合成或者來源于生物、其他天然產(chǎn)物及應用生物技術(shù)生產(chǎn)的一種物質(zhì)或者幾種物質(zhì)的混合物及其制劑。
2 農(nóng)藥分類（按作用方式分）： 
?	殺蟲劑：
     有機氯，有機磷，氨基甲酸酯，擬除蟲菊酯，沙蠶毒素類
?	殺菌劑：
     保護性殺菌劑、治療性殺菌劑、鏟除性殺菌劑
?	 除草劑：
     輸導型、觸殺型、選擇性、滅生性
3 農(nóng)藥殘留 
    由于農(nóng)藥的應用而殘存于生物體、農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境中的農(nóng)藥親體及其具有毒理學意義的雜質(zhì)、代謝產(chǎn)物和反應物等所有衍生物的總稱。
    可提取殘留 
                   結(jié)合殘留：化學鍵合或物理結(jié)合
    不可提取殘留
                   軛合殘留：酶作用
4 農(nóng)藥殘留毒性
   因攝入或長時間重復暴露農(nóng)藥殘留而對人、畜以及有益生物產(chǎn)生的急性中毒或慢性毒害。
?	農(nóng)藥對環(huán)境有益生物的毒性
    水生生物：魚類、藻類
    陸地環(huán)境生物：鳥類、害蟲天敵、蜜蜂、家蠶、非目標植物（藥害）
?	農(nóng)藥對人體健康的危害
    急性毒性：甲胺磷、水胺硫磷等高毒農(nóng)藥
    慢性毒性：致突變性、干擾內(nèi)分泌活動
    慢性神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)(遲發(fā)性神經(jīng)毒性)：有機磷農(nóng)藥特有的干擾免疫系統(tǒng)對兒童腦發(fā)育的遠期影響

二、農(nóng)藥的環(huán)境行為
1 農(nóng)藥的環(huán)境行為：農(nóng)藥進入環(huán)境后，在環(huán)境中有著復雜的遷移轉(zhuǎn)化過程，包括揮發(fā)、沉積、吸附、分解等表現(xiàn)。
?	吸附：主要指農(nóng)藥在環(huán)境中由氣相或液相向固相分配的過程。
?	遷移：施于土壤或植物體時，一部分農(nóng)藥會通過各種途徑進入氣相或通過地表徑流和淋溶的方式沉積。 
?	分解：農(nóng)藥在環(huán)境中可以通過多種方式降解。最重要的是光解和水解。
?	生物降解：微生物
?	生物富集：生物體從環(huán)境中不斷吸收低濃度的農(nóng)藥，并逐漸在其體內(nèi)積累的能力。
    1. 體表直接吸收：藻類植物、原生動物、微生物
    2. 根系吸收：高等植物
    3. 食物鏈：大多數(shù)動物
    藻類：500     魚、貝殼：2000      水鳥：10萬      
三、農(nóng)藥殘留與生態(tài)、食品安全
1 生態(tài)系統(tǒng)：是自然界一定空間的生物與環(huán)境之間相互作用、相互制約、不斷演變，達到動態(tài)平衡、相對穩(wěn)定的統(tǒng)一整體。
    農(nóng)藥主要是通過生態(tài)系統(tǒng)中的環(huán)境介質(zhì)（大氣、土壤、水）進入生態(tài)系統(tǒng)中，進而影響整個生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動。同時，也在此過程中進入生態(tài)系統(tǒng)中的不同有機生命體，進一步對生態(tài)系統(tǒng)平衡產(chǎn)生影響。
2 農(nóng)藥進入生態(tài)系統(tǒng)的途徑
農(nóng)藥進入大氣環(huán)境的途徑
?	農(nóng)藥噴灑于農(nóng)田時，逸散到大氣中（>50%）。
?	施用后，沉積在作物表面或土壤表面的農(nóng)藥通過揮發(fā)和蒸發(fā)作用進入大氣。
?	農(nóng)藥配制、加工生產(chǎn)運輸、農(nóng)作物廢棄燃燒、倉庫、車船熏蒸后的通風排放、糧食保存、纖維防蛀等也可在一定時期內(nèi)造成高濃度的大氣污染。
農(nóng)藥進入土壤環(huán)境的途徑
?	  農(nóng)藥直接施入土壤。如除草劑、拌種劑
?	  農(nóng)藥間接進入土壤。
?	  隨大氣沉降、灌溉水和動植物殘體進入土壤。
農(nóng)藥進入水環(huán)境的途徑
?	  農(nóng)藥直接施入水體。
?	  土壤中農(nóng)藥隨地面徑流或經(jīng)滲濾液通過土層至地下水
?	  農(nóng)藥廠和其他農(nóng)藥化學品生產(chǎn)廠的污水排放。
農(nóng)藥在生物體間的轉(zhuǎn)移（生物富集、食物鏈）
3 農(nóng)藥污染食品的主要途徑
?	使用農(nóng)藥防治農(nóng)作物病蟲害，直接污染食用作物。
?	農(nóng)藥被植物根部吸收后轉(zhuǎn)移至食物中。
?	施用農(nóng)藥的同時或施用后對大氣、水體的污染造成動植物體內(nèi)含有農(nóng)藥殘留，間接污染食品。
?	經(jīng)食物鏈和生物富集作用污染食品。
?	運輸及儲存過程中由于和農(nóng)藥混放造成的食品污染。

四、農(nóng)藥殘留檢測與監(jiān)控   
農(nóng)藥殘留超標是農(nóng)產(chǎn)品污染的主要問題 
1 農(nóng)藥與食品安全問題的對策
?	加快立法步驟，加強科學管理。
?	加強農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者的教育，合理用藥。
?	加大在新型、低毒、高效農(nóng)藥研制和推廣方面的投入。
?	提高農(nóng)藥殘留檢測能力和速度。
2 農(nóng)藥殘留限量標準
?	最大殘留限量（MRL，maximun residue limit）是指法定允許在食用農(nóng)產(chǎn)品和動物飼料中一種化合物殘留的最大濃度（用mg/kg 來表示)。
?	每日允許攝入量（ADI，acceptable daily intake）是根據(jù)對一種化合物已有數(shù)據(jù)的評價，消費者一生之中每天攝入這種化合物不會對身體健康造成可見風險的量（用mg/kg體重來表示）。
               ADI=NOAEL/安全系數(shù)（100）
       MRL=ADI×60/（1.2×某種食品所占比例）
3 農(nóng)藥殘留法規(guī)與管理
?	最早制定農(nóng)藥管理法的是法國（1905年），之后是美國（1910年）、加拿大（1927年）等。
?	聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）1975年設(shè)立了5個專家組：農(nóng)藥規(guī)格、農(nóng)藥登記資料要求、農(nóng)藥使用標準、食品中農(nóng)藥殘留及環(huán)境中農(nóng)藥殘留。
我國農(nóng)藥殘留法規(guī)與管理
?	1982年4月，《農(nóng)藥登記規(guī)定》。
?	1982年10月，《農(nóng)藥安全使用規(guī)定》。
?	1997年，國務院發(fā)布了《中華人民共和國農(nóng)藥管理條例》。
?	1999年，農(nóng)業(yè)部發(fā)布實施《農(nóng)藥管理條例實施辦法》 
?	2001年，修改了《農(nóng)藥管理條例》。
我國新農(nóng)藥登記資料要求
田間試驗階段：（不得銷售）
?	產(chǎn)品化學資料（有效成分，物化參數(shù)，分析方法等）
?	毒理學資料（急性毒性）
?	藥效資料（室內(nèi)活性測定，試驗作物、防治對象、施藥方法）
?	其他資料（已有的田間藥效、殘留、環(huán)境生態(tài)試驗和登記情況）
臨時登記階段（試銷，有效期1年，可續(xù)展，不得超過4年）
?	產(chǎn)品化學資料（產(chǎn)品標準）
?	毒理學資料（急性毒性試驗報告、眼睛皮膚刺激性試驗報告、致敏性試驗報告、亞慢性試驗報告、致突變性試驗報告等）
?	藥效資料（室內(nèi)活性測定報告、2年4地室外藥效報告）
?	殘留資料（可在臨時登記期間進行）
?	環(huán)境生態(tài)資料（魚、鳥、蜜蜂、家蠶的毒性試驗報告）
?	標簽、說明書
?	其他資料（在其他國家或地區(qū)的登記情況）
正式登記階段（有效期5年，可續(xù)展）
?	產(chǎn)品化學資料（2年常溫穩(wěn)定性試驗報告）
?	毒理學資料（人群接觸毒性、主要雜質(zhì)毒性、在動物體內(nèi)的代謝、每日允許攝入量等）
?	藥效資料
?	殘留資料（2年2（3）地殘留試驗報告）
?	環(huán)境生態(tài)資料（環(huán)境行為特征、非靶標生物毒性
?	規(guī)范的標簽、說明書
4 農(nóng)藥安全性評價
?	健康安全評價：評價登記產(chǎn)品在推薦施藥條件下對人的健康風險?！r(nóng)藥毒性試驗和農(nóng)藥殘留試驗結(jié)果
?	生態(tài)安全評價：評價登記產(chǎn)品在推薦使用條件下對環(huán)境生物的毒害風險?！r(nóng)藥環(huán)境行為和環(huán)境毒性試驗結(jié)果
農(nóng)藥殘留檢測的目的：
?	研究農(nóng)藥施用后再農(nóng)作物或環(huán)境介質(zhì)中的代謝、降解和轉(zhuǎn)歸，制定農(nóng)藥殘留限量標準、農(nóng)藥安全使用標準。
?	檢測食品和飼料中農(nóng)藥殘留的種類和水平，以確定其質(zhì)量和安全性。
?	檢測環(huán)境介質(zhì)和生態(tài)系生物構(gòu)成的農(nóng)藥殘留種類和水平，以了解環(huán)境質(zhì)量和評價生態(tài)系統(tǒng)的安全性。
5 農(nóng)藥殘留檢測的特點與程序
?	農(nóng)藥殘留分析的特點
      痕量性（ ng、pg、fg）； 
      復雜性 
      多樣性
?	農(nóng)藥殘留分析的程序
      樣品采集      樣品制備      樣品分析      質(zhì)量控制與數(shù)據(jù)處理
農(nóng)藥殘留分析的發(fā)展和任務
?	安全、環(huán)保、高效、經(jīng)濟；
?	樣品處理新技術(shù)——SPE,SFE,ASE,GPC
?	檢測新技術(shù)——GC,HPLC,聯(lián)用技術(shù) 
?	快速檢測技術(shù)——多殘留分析，快速篩選
?	方法的標準化；
?	監(jiān)測和管理的完善。

第二章  農(nóng)藥殘留試驗準則
1 農(nóng)藥殘留試驗的目的：了解農(nóng)藥在大田農(nóng)作物施用后的殘留消解動態(tài)以及不同施藥水平與農(nóng)藥最終殘留量的關(guān)系；并以此為重要依據(jù)，制定農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥最大殘留限量標準、農(nóng)藥安全使用標準及滿足農(nóng)藥登記的要求。
2 準則主要內(nèi)容
?	術(shù)語和定義
?	田間試驗部分
田間試驗設(shè)計和實施；樣品采集和運輸、貯藏；
田間試驗的記錄。
?	實驗室檢測部分
    方法確定；樣品檢測；數(shù)據(jù)處理；記錄。
?	試驗報告的撰寫
3術(shù)語和定義
農(nóng)藥殘留：使用農(nóng)藥后，殘存于農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境中的農(nóng)藥活性成份及其在性質(zhì)上和數(shù)量上有毒理學意義的代謝（或降解、轉(zhuǎn)化）產(chǎn)物。
推薦劑量：一種農(nóng)藥產(chǎn)品經(jīng)田間藥效試驗后，提出的防治某種作物病、蟲、草害的施藥量）或濃度）。
采收間隔期：采收距最后一次施藥的間隔天數(shù)。
安全間隔期：經(jīng)殘留試驗確證的試驗農(nóng)藥實際使用時采收距最后一次施藥的間隔天數(shù)。
田間樣品：按照規(guī)定的方法在田間采集的樣品。
實驗室樣品：田間樣品按照樣品縮分原則縮小后的樣品，用于冷凍貯藏、分析取樣和復檢。分析樣品：按照分析方法要求直接用于分析的樣品。
4 田間試驗部分
田間試驗設(shè)計是農(nóng)藥殘留試驗的前提和基礎(chǔ)。
正確的田間試驗設(shè)計是整個殘留試驗成功的關(guān)鍵所在。
依據(jù)：《農(nóng)藥殘留試驗準則》
項目：最終殘留量試驗、殘留消解動態(tài)
要素：不同施藥劑量、不同施藥次數(shù)，不同間隔期
操作：田間標準操作規(guī)程
田間試驗設(shè)計SOP
殘留試驗背景資料調(diào)查（農(nóng)藥殘留試驗背景資料調(diào)查表（SOP FT-05-01）） 
供試農(nóng)藥：有效成份/制劑種類/商品名/通用名
供試作物：品種/生育周期
農(nóng)藥應用情況：防治對象/適用期/推薦使用劑量/施用次數(shù)/施藥間隔/安全間隔期 
理化性質(zhì)：化學名稱/分子式/理化性/溶解度/穩(wěn)定性
農(nóng)藥相關(guān)數(shù)據(jù)：LD50/ADI/MRL 
農(nóng)藥代謝：有毒代謝產(chǎn)物
殘留分析方法：方法原理/相關(guān)介質(zhì)中的方法     
試驗地的選擇
1.必須選擇兩個以上不同的氣候生態(tài)種植區(qū)域（試驗地點）。
2.根據(jù)試驗作物的不同，確定試驗地點的數(shù)量
●三地：水稻、小麥、甘藍、黃瓜、番茄（辣椒）、柑桔、梨（蘋果）、大豆、茶、花生。
●一地：榴蓮、亞麻籽、可可、咖啡、調(diào)味品類、香草類等。
●二地：其它作物。
3.選定的種植區(qū)域（試驗地點）內(nèi)，選擇有代表性的試驗地。
4.選擇作物長勢均勻，地勢平整的地塊。試驗前了解試驗地的土壤類型、用藥歷史等。
5.試驗地的灌溉條件需滿足殘留試驗的要求。
    如：單獨灌溉、不可串灌、渠水流向等。
6.試驗地應有足夠的作物面積，且相對集中，保證足夠的緩沖區(qū)與處理區(qū)。
7.試驗地與外界須設(shè)置有效的隔離。
8.按要求設(shè)置各處理小區(qū)，做好標記。
最終殘留量測定試驗
檢測對象：一般為作物的可食部位和種植地土壤。
施藥劑量：設(shè)兩個施藥劑量（推薦劑量的高劑量與1.5倍劑量）。g(ai)/ha或mg/kg
施藥次數(shù)：設(shè)兩個施藥次數(shù)（除草劑、土壤處理劑、種子處理劑、植物生長調(diào)節(jié)劑等可不增加次數(shù)）
施藥間隔：依據(jù)推薦的施藥間隔或藥效試驗結(jié)果。
采收間隔期：以作物農(nóng)產(chǎn)品的收獲時期作為樣品采收時期，根據(jù)防治情況和推薦采收間隔期確定試驗采收間隔。設(shè)兩個以上采收間隔期，第二年做相應調(diào)整。
施藥方法：依據(jù)推薦施藥方法施藥。
施藥時間：以農(nóng)作物的收獲期進行倒推設(shè)計。
殘留消解動態(tài)試驗
檢測對象：可食部分、植株。
施藥劑量：推薦劑量高劑量的1.5倍。
施藥時間：作物生長期，一般為作物生長至成熟個體一半大小時開始施藥。
土壤（水）試驗：可在種植地附近選擇一塊土質(zhì)相同的空白地進行。
采樣間隔和次數(shù)：一般采用一次施藥多次采樣的方法進行。通常采樣間隔可設(shè)計為0,1,3,7,10,14,21,30,45d等。要求有效采樣次數(shù)不少于6次，降解率一般應達到90%以上。田間試驗的處理和小區(qū)設(shè)計
處理數(shù)量：原則上一個施藥劑量、一個施藥次數(shù)和一個采收間隔期為試驗的一個處理。
處理重復：每個處理設(shè)3個重復
小區(qū)面積：糧食作為≥30 m2，葉菜類蔬菜≥15 m2，果樹不少于2棵。
空白對照
小區(qū)保護行：設(shè)置保護行或田?。ň彌_、漂移、串流）
田間施藥
?	供試農(nóng)藥的接收、貯存、使用和處置
?	施藥前做好前期準備工作
?	避免對人員、試驗樣品的污染
?	施藥器械的清洗和維護
?	應選擇風速小于3m/s的晴朗天氣施藥
?	施藥健康與安全
?	按SOP中不同作物的田間施藥標準操作規(guī)程進行
樣品采集和運輸、貯藏
?	采樣方法
選擇合適的采樣方法：隨機法、對角線法、五點法有選擇地，按劑量從小到大順序采樣避免在地頭或邊沿采樣（留0.5m邊緣）
?	采樣量及采樣部位
按照附錄A《作物分類及采樣部位和推薦采樣量》及SOP中不同作物田間樣本采集與實驗室樣品制備標準操作規(guī)程確定采樣部位和采樣量。    
?	樣品處置
避免樣品表面殘留農(nóng)藥的損失（采集、包裝、制備）
避免樣品損壞及變質(zhì)（采集、運輸）
避免交叉污染（采集、制備）
樣品上粘附的土壤等雜物可用軟刷子或干布處理干凈。
?	樣品縮分
按照SOP中各種作物樣品制備標準操作規(guī)程縮分。
個體較小的樣品（如麥粒和小粒水果）用四分法進行縮分；谷物等樣品先粉碎，全部過20目篩，最后取100-200克樣品保存待測。中等個體的樣品（如豆莢），可在充分混合的田間樣品中隨機選取足夠量的樣品。土壤樣品不能風干，過1mm篩，最后取200-500g樣品保存。（測定時校正干土殘留量）不能過篩的去掉植物殘枝和石礫后保存。    
?	樣品包裝和貯藏
采集的每個樣品應寫好標簽，24h內(nèi)運送到實驗室。
樣品送達實驗室后賦予每個樣品唯一編號。
樣品需用干凈的、牢固的容器包裝，并盡快保存在   冷凍或冷藏冰箱中。
檢測后的樣品需保存至少半年時間，以供復檢。
田間試驗的記錄：試驗記錄應及時、清晰、詳細、準確。
農(nóng)藥殘留試驗背景資料調(diào)查表（SOP FT-05-01）
農(nóng)藥收發(fā)、使用和保存記錄表（SOP FT-05-05）
田間試驗設(shè)計（SOP FT-05-02.1） 
試驗地點選擇（SOP FT-05-06.1） 
試驗地信息和小區(qū)布置圖（SOP FT-05-06.2）
試驗地耕種與管理歷史（SOP FT-05-06.3）
供試作物的耕作管理調(diào)查記錄表（SOP FT-05-06.4）
5 實驗室檢測部分
?	術(shù)語與定義
最小檢出量（LOD）：指使檢測系統(tǒng)產(chǎn)生3倍噪音信號所需待測物的質(zhì)量(以ng為單位)。
最低檢測濃度（LOQ）：指用添加方法能檢測出待測物在樣品中的最低含量(以mg/kg為單位)。
方法性能指標：靈敏度、準確度、精密度
檢測方法研究
?	方法選擇：
    查文獻/化合物理化性質(zhì)/分析儀器/方法評價
?	最低檢測濃度：
     MRL /儀器方法/前處理方法
?	標準曲線：至少5個濃度
?	回收率：至少2個添加濃度，5個重復
?	精密度：相對標準偏差（RSD）
評價標準
添加濃度（mg/kg）	平均回收率（70%）	添加濃度（mg/kg）	平均回收率（70%）
>1	70-110	>1	10
0.1-1	70-110	0.1-1	15
0.01-0.1	70-110	0.01-0.1	20
0.001-0.01	60-120	0.001-0.01	30
≤0.001	50-120	≤0.001	35
結(jié)果計算和表達
?	殘留量應為農(nóng)藥母體及其有毒代謝物，降解物的總和，以mg/kg表示。
?	當檢測值低于LOQ時，應寫50時，就可以得到對稱的峰形曲線。在氣相色譜中，一般n約103~106，因而這時的流出曲線可趨于正態(tài)分布。
2-3.速率理論
塔板理論的缺點：
?	快速平衡的假設(shè)是難以實現(xiàn)的；
?	流動相的不連續(xù)流動是不符合實際的；
?	忽略了因濃度差等因素引起的縱向擴散；
?	流出曲線方程未能描述色譜參數(shù)如載氣流速、固定相性質(zhì)等對峰展寬的影響。 
速率理論及影響柱效率的因素
   范弟姆特等的速率理論認為：色譜峰擴展的原因是受渦流擴散、分子擴散、氣流兩相間傳質(zhì)阻力的影響。
   H=A+B/μ+Cμ 
   式中A為渦流擴散項，B/μ為分子擴散項，Cμ為傳質(zhì)阻力項，μ為載氣線速度。 
?	渦流擴散項 A=2λdp 
     λ為反映柱填充狀態(tài)的系數(shù)，對于給定的色譜柱； dp為填料的顆粒直徑?？梢娫谔畛渲?，填料粒度越小越有利。
?	縱向擴散項 B/μ=2Dm/ μ 
    Dm為樣品組分在流動相中的分子擴散系數(shù)。所以較高的載氣流速和黏度大的流動相（或在較低柱溫下）有利于抑制縱向擴散。
?	傳質(zhì)阻力項 Cμ=(Cm+Cs) μ 
    傳質(zhì)阻力項與載氣流速成正比，流速越快越不利于平衡的建立。
     薄的液膜和大的擴散系數(shù)（或在較高柱溫下）有利于傳質(zhì)。
?	  最佳載氣流速μopt和最小理論塔板高度Hmin

?	分離條件的優(yōu)化
   1. 在柱長一定的條件下，采用接近μopt的載氣流速，小內(nèi)徑的色譜柱，如果是填充柱就采用較小的填料粒度。
    2. 改變柱溫（程序升溫）
    3. 改變固定相，即更換色譜柱
    4. 利用化學作用，如通過衍生化反應改變待   測物的結(jié)構(gòu)。 
4.2 氣相色譜儀器及操作
儀器的基本配置：
?	氣路系統(tǒng)：高壓鋼瓶、減壓閥、凈化管、穩(wěn)壓閥、壓力表、流量計等。
?	進樣系統(tǒng)：進樣器和氣化室
?	柱系統(tǒng)：色譜柱和恒溫箱
?	檢測系統(tǒng)：檢測器、恒溫室和放大器
?	記錄和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
    幾種高檔GC儀器的配置
儀器型號	廠商	氣路系統(tǒng)	進樣系統(tǒng)	檢測系統(tǒng)	控制及數(shù)據(jù)處理

Agilent-6890 
	美國
安捷倫 
	電子氣路控制(EPC)
也可選擇手動控制	可同時配置兩個進樣口 
	可同時配置兩個檢測器 
	可全部由工作站控制，也可用積分儀控制；主機有控制鍵盤。 
GC-17A 
	日本
島津 
	高級氣流控制(AFC)
也可選擇手動控制 	可同時配置三個進樣口
	可同時配置三個檢測器 
	可全部由工作站控制，也可用積分儀控制；主機有控制鍵盤。 
3800GC 
	美國
瓦里安 
	電子氣流控制(EFC)
也可選擇手動控制 	可同時配置三個進樣口
	可同時配置三個檢測器 
	可全部由工作站控制，也可用積分儀控制；主機有控制鍵盤。 
氣路系統(tǒng)
?	氣源：就是為GC提供載氣或輔助氣體的高壓鋼瓶或氣體發(fā)生器。
   純度要求：99.999%
   凈化裝置：分子篩、變色硅膠
   鋼瓶放置位置：實驗室以外的安全地方
?	氣路控制系統(tǒng)
   氣路控制系統(tǒng)的好壞直接影響分析重現(xiàn)性。
   常見問題：泄露問題
   EPC：電子壓力傳感器和電子流量控制器
?	流量控制準確，重現(xiàn)性好
?	可實現(xiàn)載氣的多模式操作
?	使儀器體積更小
?	使自動化程度更高
?	儀器更省氣
?	操作更安全

進樣系統(tǒng)
進樣口結(jié)構(gòu)與技術(shù)指標：
    進樣系統(tǒng)包括樣品引入裝置（注射器和自動進樣器）和汽化室。
   幾項技術(shù)指標：
?	操作溫度范圍：350~420℃
?	載氣壓力和流量設(shè)定范圍：0~100psi，0~200ml/min。
?	惰性：不對樣品發(fā)生吸附作用或化學反應。需插入石英玻璃襯管
?	隔墊吹掃功能（3ml/min）
常見GC進樣口及其選擇：
   常見GC進樣口和進樣技術(shù)：
?	填充柱進樣口：最簡單的進樣口，所有汽化的樣品均進入色譜柱，可接玻璃和不銹鋼填充柱，也可接大口徑毛細管柱進行直接進樣。
?	分流/不分流進樣口：最常用的毛細管柱進樣口。分流進樣最為普遍，操作簡單，但有分流歧視和樣品可能分解的問題，不分流進樣雖然操作復雜一些，但分析靈敏度高，常用于痕量分析。
?	冷柱上進樣口：樣品以液體形態(tài)直接進入色譜柱，無分流歧視問題。分析精密度高，重現(xiàn)性好。尤其適用于沸點范圍寬、或熱不穩(wěn)定的樣品，也常用于痕量分析（可進行柱上濃縮）。
?	程序升溫進樣口：將分流/不分流進樣和冷柱上進樣結(jié)合起來，功能多，適用范圍廣，是較為理想的GC進樣口。
?	大體積進樣：采用程序升溫汽化或冷柱上進樣口，配合以溶劑放空功能，進樣量可達幾百微升，可大大提高分析靈敏度，在環(huán)境分析中應用廣泛，但操作較為復雜。
?	頂空進樣：只取復雜樣品基體上方的氣體部分進行分析，適合于環(huán)境分析、食品分析及固體材料中的可揮發(fā)物分析等。
?	裂解進樣：在嚴格控制的高溫下將不能汽化或部分不能汽化的樣品裂解可汽化的小分子化合物，進而用GC分析，適合于聚合物樣品或地礦樣品等。
進樣口和操作參數(shù)的選擇應注意的問題：
?	樣品的穩(wěn)定性：在保證樣品有效汽化的前提下，進樣口溫度應盡可能的低一些。
?	進樣口對峰展寬的影響：   
   一般地講，進樣量小一些、進樣口溫度高一些、載氣流速快一些、汽化室體積小一些、分流比大一些都對窄的初始譜帶寬度有利。
   固定相聚焦：初始柱溫要低。
   溶劑聚焦：初始柱溫要比溶劑溫度至少低10℃。 
   熱聚焦：初始柱溫低于待測分析樣品的沸點150 ℃。
?	隔墊和襯管
   要選擇耐高溫的隔墊，并定期檢查是否漏氣，需要時及時更換。
   襯管能起到保護色譜柱的作用，注意及時清洗和更換。
柱系統(tǒng)
   GC儀器的柱系統(tǒng)包括柱箱、色譜柱以及色譜柱與進樣口和檢測器的連接頭。色譜柱是色譜分離的心臟。
色譜柱的類型與選擇：
         填充柱
色譜柱              填充型
         毛細管柱           涂壁開管柱（WCOT）
                    開管型 
                            多孔層開管柱（PLOT）
填充柱
?	色譜柱的材料和形狀：色譜柱可用玻璃管、不銹鋼管等材料制成。常用的有U形和螺旋形，內(nèi)徑一般在2~4mm，柱長0.5~2m。
?	固定液：固定液的不同直接影響到待測組分的分離效能，固定液的選擇是色譜分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié),其基本原則也是“相似相溶”原理。
毛細管色譜柱
毛細管的特點：柱效能高、柱滲透率大、柱容量小，分辨能力、靈敏度、分析速度以及色譜柱的相對惰性都優(yōu)于填充柱。
色譜柱操作注意事項：
色譜柱安裝：
?	先將密封墊套在柱頭，此時應將柱頭朝下，避免密封墊碎屑進入柱管造成堵塞。將石墨墊套在柱頭后，應將柱頭截去1~2cm。
?	柱端伸出密封墊的長度不同儀器有不同的規(guī)定，應嚴格按儀器說明書確定。
?	接頭不要擰得太緊，以免將色譜柱壓裂或壓碎。
色譜柱的老化：先接通載氣，然后將柱溫從60℃以5~10 ℃的速率程序升溫到色譜柱的最高使用溫度以下30 ℃或者實際操作溫度以上30 ℃，并在高溫時恒溫30~120min，直到所記錄的基線穩(wěn)定為止。
?	暫時不用的色譜柱從儀器上卸下后，柱兩端應當用一塊硅橡膠（可利用廢進樣隔墊）堵上。并放在相應的柱包裝盒中。
?	每次開機前都應先開載氣，再開儀器、工作站，再設(shè)定方法；關(guān)機前都應將柱箱溫度降到50℃以下，然后再關(guān)電源和載氣。
?	使用時不能超過柱子的最高使用溫度。
檢測系統(tǒng)
?	檢測器是測量柱后流出物質(zhì)成分和濃度變化的裝置，通過化學和物理作用，將流出物質(zhì)成分和濃度的變化轉(zhuǎn)換為電信號。
           積分型
   檢測器           濃度型（TCD，ECD）
           微分型 
                    質(zhì)量型（FID，F(xiàn)PD，NPD）
檢測器的性能指標：
?	噪音：在沒有樣品進入檢測器的情況下，檢測器或放大器本身以及其他操作條件引起基線在短時間內(nèi)的起伏。
?	靈敏度：單位時間或單位體積載氣內(nèi)一定量的物質(zhì)通過檢測器時所產(chǎn)生的信號的大小。
?	最小檢出量（limit of detection, LOD)：檢測系統(tǒng)產(chǎn)生3倍噪音信號所需待測物的質(zhì)量（以ng為單位表示。
?	最低檢測濃度（limit of quantification, LOQ)：用添加方法能檢測出待測物在樣品中的最低含量（以mg/kg為單位表示）。   
?	線性范圍：指被測組分的量與檢測器響應信號成線性關(guān)系的范圍，通常用保持線性的最大進樣量與最小檢出量的比值表示。
常用檢測器：
火焰離子化檢測器（FID）
火焰光度檢測器（FPD）
電子捕獲檢測器（ECD）
氮磷檢測器（NPD）
火焰離子化檢測器（FID）
?	特點：
   能檢測大多數(shù)含碳有機化合物，結(jié)構(gòu)簡單，性能穩(wěn)定，靈敏度較高，線性范圍寬。
?	結(jié)構(gòu)：
    離子室（主體）
    石英噴嘴
    極化極和收集部件
?	工作原理：
    是一個化學電離的過程，有機物在火焰中燃燒生成自由基，然后與氧產(chǎn)生正離子，再同水反應生成H3O+離子。正離子及電子在電場作用下向收集電極和發(fā)射電極做定向移動從而形成微電流，經(jīng)放大后記錄下色譜峰。
?	影響靈敏度的因素：
    檢測器的結(jié)構(gòu)
    操作條件：
    氫氣、載氣、空氣流速及其比例：
                  氫氣  40ml/min，空氣450ml/min 
    檢測器溫度：250~330℃
    尾吹氣流速: 20-60ml/min 
火焰光度檢測器（FPD）
?	特點：
   也稱硫、磷檢測器。對含硫或磷的化合物具有較高的選擇性和靈敏度，檢出限可達
   10-12g（對P）或10-11g（對S）。廣泛用于有機磷和有機硫農(nóng)藥殘留量的測定。
?	結(jié)構(gòu)：
   氫火焰：與FID檢測器類似
   光度測定：包括石英窗、濾光片和光電倍增管
?	工作原理：
   從色譜柱進入檢測器的含硫或含磷化合物在富氫火焰中燃燒時，生成化學發(fā)光物質(zhì)，并能發(fā)射出特征波長的光，這些特征光譜再通過特征濾光片并放大記錄就能檢測硫和磷。
   硫濾光片的波長是394nm，呈藍紫色。
   磷濾光片的波長是526nm，呈黃綠色。
?	影響靈敏度的因素：
   濾光片類型
   氫氣、空氣流速及其比例：氫氣75ml/min，空氣100ml/min 
   尾吹氣流速： 30-60ml/min
   檢測器溫度：250℃
?	工作原理：
    銣珠被加熱后，銣珠的周圍有揮發(fā)的銣原子，處于熱激發(fā)狀態(tài)。無樣品時，氣化的銣原子與火焰中的各種基團反應生成Rb+，被負極的銣珠吸引返回表面，中和后又再次揮發(fā)；而火焰中產(chǎn)生的各種基團獲得電子成為負離子，負離子與電子被正極的收集極吸引和收集，形成本底基流。含氮和磷化合物進入銣珠周圍完全燃燒成游離基，這些游離基團從氣化的銣原子獲得電子，向收集極遷移形成電流。
?	影響靈敏度的因素：
    加在銣珠上的電壓：電壓越大，靈敏度越高，但銣珠壽命會降低。
    氫氣、空氣流速及其比例：
         氫氣3ml/min，空氣60ml/min
常用GC檢測器的特點和技術(shù)指標
檢測器	類型	最高操作溫度/℃	最低檢出限/g/s	線性范圍	主要用途
FID

ECD

NPD

FPD
	質(zhì)量型
通用型
濃度型
選擇型
質(zhì)量型
選擇型
質(zhì)量型
選擇型
	450

400

250
	10-10~10-11

10-13~10-14

10-12~10-13

10-11~10-12	107 
104
105
硫 105
磷 106 
	適用于各種有機化合物的分析
適合分析含電負性元素的有機化合物
適合于含氮或磷的化合物

適合于含硫或磷的化合物

4.3 定性與定量分析
定性分析：
?	利用保留值的定性分析：
   利用已知純物質(zhì)對照定性，在一定操作條件下，任何組分都有一個確定的保留值。
?	雙柱、多柱定性：不同物質(zhì)在同一色譜柱上可能具有相同的保留值，用兩根或多根不同極性的色譜柱進行分析，考察樣品的純物質(zhì)保留值的變化作為定性依據(jù)。
?	與其他方法結(jié)合定性：氣相色譜與質(zhì)譜、光譜、核磁共振等儀器配合進行未知組分定性。
定量分析：
    定量分析就是根據(jù)色譜峰的峰高或峰面積來計算樣品中各組分的含量。
    常用的定量方法：
    外標法：已知濃度的標準樣品與待測樣品在完全相同的條件下進行色譜分析，以兩者的峰高或峰面積的比較計算樣品的 濃度。
樣品中的濃度= 樣品的峰面積（峰高）
              標準樣品的峰面積（峰高）  ×標準樣品的濃度      
標準曲線法：以標準樣品作濃度與峰值關(guān)系圖，然后根據(jù)測得的待測樣品峰值從峰值-濃度關(guān)系曲線圖查濃度。 
    特點：外標法較為簡便，不需要校正因子，但進樣量要求十分準確，操作條件也需嚴格控制。
內(nèi)標法：在試樣中加入能與所有組分完全分離的已知量的內(nèi)標物質(zhì)，用校正因子校正待測組分的峰值，并與內(nèi)標物質(zhì)的峰值進行比較，求出待測組分含量的方法。
      特點：準確性較高，對儀器操作條件要求不高，但具體操作較麻煩。
   面積歸一化法：樣品中所有組分全部流出色譜柱，并在色譜圖上都出現(xiàn)色譜峰，可以通過各組分的峰面積計算各組分的含量。
      特點：簡單但不準確。

第二節(jié) 高效液相色譜檢測方法
氣相色譜與液相色譜的比較
類別	氣相色譜	液相色譜
流動相	氣體(He,N2,H2)	液體
固定相	多（數(shù)百種）	較少（十幾種）
分析對象	可揮發(fā)且熱穩(wěn)定，沸點<500℃	不受樣品揮發(fā)性和穩(wěn)定性的限制
檢測技術(shù)	多（FID，ECD，NPD，F(xiàn)PD，MS）	少（UV-Vis，熒光，電化學，MS）
制備分離	煩瑣	簡便
1 液相色譜分類
?	平面色譜（薄層色譜和紙色譜）
?	柱色譜：經(jīng)典柱色譜（低壓）
            高效液相色譜（高壓）
            液固吸附色譜
            液液分配色譜（鍵合相色譜）
            離子交換色譜
            空間排阻色譜
根據(jù)固定相和流動相相對極性有兩種操作  方式：
    正相色譜：固定相>流動相
    反相色譜：固定相5000）
    高檔儀器：質(zhì)量范圍>4000，高分辨率（>10000）
   質(zhì)譜儀通常由進樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測器和記錄系統(tǒng)及高真空系統(tǒng)等部分組成。
?	進樣系統(tǒng)：
   作用是將待測物質(zhì)送進離子源。
   直接進樣：由進樣桿和真空安全鎖定裝置構(gòu)成。
   間接進樣：經(jīng)GC或HPLC分離后進到離子源內(nèi)。
?	離子源或電離室
      離子源的作用是使試樣中的原子、分子轉(zhuǎn)化成離子，是質(zhì)譜儀的核心，直接影響質(zhì)譜儀的靈敏度和分辨能力。
      使用何種電離方式取決于：
1.	樣品的狀態(tài)（液體、固體），極性、揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性；
2.	需探尋的樣品信息類型（分子結(jié)構(gòu)或序列分析）
電離技術(shù)：
  “硬”電離技術(shù)：電離能量較高，生成較多碎片離子，如EI源。
  “軟”電離技術(shù)：電離能量較低，生成的碎片離子較少，如CI源、ESI、APCI。
電子電離（Electron impact，EI）源：
EI源是研究最早、技術(shù)最成熟、應用最廣泛的離子源。
   主要由電離室（離子盒）、燈絲、離子聚焦透鏡和一對磁極組成。
EI源的優(yōu)缺點：
   優(yōu)點：非選擇性電離；離子化效率高；靈敏度高；提供豐富的結(jié)構(gòu)信息；有龐大的標準譜庫供檢索。
   缺點：樣品必須能氣化，不適于難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的樣品；有可能得不到分子量信息。
化學電離（Chemical Impact，CI）源：
CI源結(jié)構(gòu)與EI源相似，主要區(qū)別時氣密性較好。
   原理是利用高能量的電子（100eV）轟擊反應氣體（甲烷、異甲烷、氨氣等），使之電離，電離后的反應分子再與有機化合物樣品分子發(fā)生碰撞，進行分子-離子反應而生成樣品分子離子的一種軟電離方法。
CI源的優(yōu)缺點：
   優(yōu)點：是獲得分子量信息的重要手段。
   缺點：樣品必須能氣化；譜圖重復性不如EI源，沒有標準譜庫；反應試劑容易形成較高本底，影響檢測限；操作比EI源難一些，反應試劑的壓力需要摸索。
電噴霧電離源（ESI）：
ESI由大氣壓腔、真空接口和離子傳輸區(qū)構(gòu)成。
   原理：ESI是在高靜電梯度下，使樣品溶液發(fā)生靜電噴霧，在干燥氣流中，形成帶電霧滴，隨著溶劑的蒸發(fā)，通過離子蒸發(fā)等機制，生成氣態(tài)離子，以進行質(zhì)譜分析的過程。
?	質(zhì)量分析器（mass analyzer）
     是質(zhì)譜儀的離子分離系統(tǒng)。作用是將離子源產(chǎn)生的離子按照質(zhì)荷比m/z進行分離檢測，得到化合物特征質(zhì)量信息。
   常用的有：
   四極桿質(zhì)量分析器
   離子阱質(zhì)量分析器
   飛行時間質(zhì)量分析器
   扇形磁場分析器  
特性：
1.	根據(jù)離子在不同場的運動規(guī)律實現(xiàn)質(zhì)量分離
2.	只檢測帶電粒子，測定的是離子的質(zhì)荷比
3.	只檢測氣相離子，必須在真空狀態(tài)下工作。   
單四極桿質(zhì)量分析器（single quadrupole，Q）
     由四根嚴格平行并與中心軸等間隔的雙曲面柱狀或圓柱形電極構(gòu)成的正、負兩組電極組成。
     兩組電極間施加一定的直流電壓和射頻交流電壓，
     最終只有共振離子能夠到達檢測器。
   
     有全掃描和選擇離子監(jiān)測兩種不同掃描模式，多配置EI和正、負CI離子源。
     優(yōu)點：掃描速度快，靈敏度高，體積小。
     缺點：是分辨率較低。
三重四極質(zhì)量分析器（trip quadrupole，Q-Q-Q）
   是由三組四極串接起來的質(zhì)量分析器，第一組和第三組是質(zhì)量分析器，中間一組時碰撞活化室。
   優(yōu)點：比Q的SIM選擇性更好，排除干擾能力更強，信噪比更高。
離子阱質(zhì)量分析器（ion trap）
   由一個具有雙曲線表面中心環(huán)形電極和上下2個端電極間構(gòu)成一個三維四極場。
   也是利用交變的高頻電場使離子源注入的離子產(chǎn)生振蕩，先將離子儲存在“肼”里，然后改變電場按不同質(zhì)荷比將離子推出“肼”外進行檢測。
    
   優(yōu)點：在不增加質(zhì)量分析器數(shù)量的前提下，就能達到10級MS-MS的分析。
   缺點：靈敏度較低。 
飛行時間質(zhì)量分析器（TOF-MS）
   是最簡單的質(zhì)量分析器，它與離子的飛行速度和質(zhì)量相關(guān)。
   線性同軸的飛行試劑質(zhì)量分析器由一段無場的飛行管構(gòu)成。
   離子束被高壓加速以脈沖方式推出離子源進入飛行管，“自由漂移”到達檢測器。
   優(yōu)點：掃描速度快、質(zhì)量范圍寬、分辨率高。
   缺點：價格高，主要用于生物質(zhì)譜領(lǐng)域
?	離子檢測器
   離子檢測器的功能是接收由質(zhì)量分析器分離的離子，進行離子記數(shù)并轉(zhuǎn)換成電壓信號放大輸出，再經(jīng)計算機采集和處理，最終得到按不同m/z排列和對應離子豐度的質(zhì)譜圖。
   檢測器有法拉第杯、閃爍計數(shù)器、電子倍增器和光電倍增管等。
?	真空系統(tǒng)
   什么叫真空？
   在質(zhì)譜真空中，常用Torr作為測量單位。
          1 Torr=1mmHg=133.3Pa=0.00133bar

為什么要真空？                                                               運動的氣體分子，在發(fā)生相互作用之前所飛越的平均距離。
1.	提供足夠的平均自由程；        
2.	提供無碰撞的離子軌道；        
3.	減少離子-分子反應； 
4.	減少背景干擾，增加
      靈敏度。
   5.   延長燈絲壽命；
高真空系統(tǒng)一般由機械泵和油擴散泵或分子渦輪泵串聯(lián)組成。
   
   機械泵作為前級泵，真空度達10-2Torr以下。       
   油擴散泵或分子渦輪泵作為高真空泵，真空度達10-5~10-8Torr以下。

2 氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)
?	GC與MS聯(lián)用的有利條件：
     GC分離與MS分析過程都是在氣態(tài)下進行的；
     GC分析的化合物沸點范圍適于MS分析；
     GC分離的組分足夠MS檢測。
    不利條件：兩者的工作壓強不同。
?	   GC-MS的特點 
1.	氣相色譜作為進樣系統(tǒng)，極大地提高了混合物的分離、定性、定量分析效率；
2.	質(zhì)譜作為檢測器，解決了氣相色譜定性的局限性，既是一種通用型檢測器，又是有選擇性的檢測器；
3.	可得到質(zhì)量、保留時間、強度三維信息。
4.	凡可用GC進行殘留分析的農(nóng)藥品種都可以采用GC-MS的方法。   
?	氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)的基本構(gòu)造 
   氣相色譜儀：進樣、組分分離系統(tǒng)
   接口：傳輸線、匹配器
   質(zhì)譜：質(zhì)荷比分離、離子檢測器
   計算機系統(tǒng)：操作系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理器
?	氣相色譜儀特殊要求 
1.	氣相色譜的流動相：氦氣（99.995%）；
2.	選擇低流失的GC-MS專用的色譜柱（250um）；
3.	一般不配備氣相色譜儀常用的選擇性檢測器；
4.	使用耐高溫、低流失的進樣硅膠墊。
?	接口技術(shù)
   分流型接口
   噴射式分子分離器
   直接導入型接口：由一根金屬導管和加熱套以及溫度控制和測溫元件組成。 
?	GC-MS的定性定量分析
   定性：保留時間
              標準譜庫（分子離子峰和碎片離子）
   定量：特征離子峰面積+ 2~3個定性離子

3 液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)
?	LC/MS聯(lián)用的主要困難
HPLC	MS
高壓液相操作；
液體進入離子源轉(zhuǎn)變成大量氣體；
質(zhì)量范圍無限制；
常常使用無機鹽緩沖劑。	要求高真空；
只允許有限的氣體進入離子傳輸系統(tǒng)；
測定質(zhì)量取決于m/z和質(zhì)譜儀的類型；
需采用揮發(fā)性緩沖鹽。
?	LC-MS的特點：
1.	凡可用LC進行殘留分析的農(nóng)藥品種都可以采用LC-MS的方法；
2.	LC的最佳分離條件的選擇往往受到質(zhì)譜儀的限制；
3.	LC-MS接口標準化問題還未解決，尚沒有健全的標準譜庫，定性需手工解析。
?	LC/MS的基本配置
   高效液相色譜儀：進樣、組分分離系統(tǒng)
   接口：離子源（ESI、APCI）
   質(zhì)譜：質(zhì)荷比分離、離子檢測器
   計算機系統(tǒng)：操作系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理器

第四節(jié) 農(nóng)藥殘留免疫測定技術(shù)
1免疫分析方法（immunoassay, IA）
是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應為基礎(chǔ)，把抗體作為生物化學檢測器對化合物、酶或蛋白質(zhì)等物質(zhì)進行定性和定量分析的一門技術(shù)。
            高特異選擇性
              高靈敏度
              價廉
              快速、簡便
免疫分析技術(shù)基礎(chǔ)
1.  抗原（antigen，Ag）：
     是一類能夠引起機體特異性免疫應答，并能與相應抗體或T細胞受體發(fā)生特異反應的物質(zhì)。
     具兩種特性：
      免疫原性：誘導刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或者激活淋巴細胞產(chǎn)生免疫應答的能力。具有這種特性的物質(zhì)稱為免疫原（immunogen）。
      抗原性：與抗體反應的性質(zhì)，這種結(jié)合反應具有特異性。
抗原的理化性質(zhì)：
?	   抗原的分子量一般都較大(>10kDT)；
?	   抗原分子還要有一定的分子組成和結(jié)構(gòu)；
?	   物質(zhì)與機體的種屬關(guān)系越遠，免疫原性越強。
半抗原（hapten ）
   只有抗原性，沒有免疫原性的物質(zhì)就稱為半抗原，與載體偶聯(lián)后就形成完全抗原。
免疫分析的技術(shù)環(huán)節(jié)
 
半抗原的設(shè)計與合成
?	具備與待測物類似的立體化學特征；
?	能與載體共價結(jié)合的一個活性基團(如-NH2、-COOH、-OH和-SH等) ；
?	活性基團與載體之間具有一定長度的間隔臂（4-6個碳鏈長度）。
結(jié)構(gòu)鑒定：質(zhì)譜、核磁、紅外
不同分子結(jié)構(gòu)的半抗原設(shè)計
 
人工抗原的制備與鑒定
常用的載體蛋白：
   人血清蛋白（HAS， MW 60000 ）、牛血清白蛋白（BSA ，MW 67000 ）、   卵清蛋白（OVA， MW 45000 ）   
半抗原與蛋白偶聯(lián)的常用方法 
1.含羧基(-COOH)的半抗原 
     碳二亞胺法（CDI）、混合酸酐法（MA）
2.含氨基(-NH 2)的半抗原 
     重氮化法、丙烯酸法、鹵代硝基苯法
3.含羥基（-OH）的半抗原
      琥珀酸酐法、戊二醛法
4.含巰基（-SH）的半抗原
     SAMSA（S-乙?；鶐€基琥珀酸酐法）
純化：透析
人工抗原結(jié)合比的測定：
分光光度計法、電泳法、放射性標記法、三硝基苯磺酸法、電子噴霧質(zhì)譜法
結(jié)合比的適合度：
免疫抗原：10-40
包被抗原或標記半抗原：2-10
影響結(jié)合比的因素：
投料比、反應介質(zhì)的pH值、
反應時間、反應溫度
2.  抗體
   抗體是指機體受抗原刺激后，在體液中出現(xiàn)一種能與相應抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白（immunoglobulin，Ig）。含有免疫球蛋白的血清稱為抗血清。
抗體的結(jié)構(gòu)
   Ig有很多類型(A、D、E、G、M、Y、N)，
   但其基本結(jié)構(gòu)均由2條輕鏈（L鏈）和2條重鏈（H鏈）組成，經(jīng)二硫鍵連接構(gòu)成Y型結(jié)構(gòu)。
?	抗體的產(chǎn)生
   體液免疫：B細胞控制，產(chǎn)生抗體   
   細胞免疫：T細胞控制，產(chǎn)生淋巴因子
   產(chǎn)生過程分三個階段：
   感應階段：活化和識別免疫原
   反應階段：淋巴細胞增殖、分化
   效應階段：產(chǎn)生抗體
抗體的制備
?	 多克隆抗體技術(shù)
     抗原→免疫動物→分離抗血清→純化抗體（辛酸-硫酸胺沉淀法）
?	 單克隆抗體技術(shù)
?	 重組抗體技術(shù)
?	佐劑
    提高動物機體對免役原刺激的應答能力。
弗氏佐劑（Freund’s adjuvant）：一種含有穩(wěn)定劑的礦物油，能與免疫原形成穩(wěn)定的油包水型水乳劑，能引起機體局部形成肉芽腫，起富集巨噬細胞和免疫活性細胞的作用。
不完全佐劑：羊毛脂和石蠟油按一定比例混合后乳化而成
完全佐劑：加入一定量的卡介苗（0.5mg/mL）
抗體性質(zhì)的評價
   效價：對給定的測試反應，能給出可觀察到的抗原與抗體之間的反應時，抗血清的最大稀釋倍數(shù)。
   親和力：表示抗原決定簇和抗體結(jié)合位點之間的牢固度，常用親和常數(shù)表示。
   特異性：指抗血清對相應的抗原及結(jié)構(gòu)相似抗原的識別能力，通常用交叉反應表示。

多克隆抗體與單克隆抗體的比較
項目	多克隆抗體	單克隆抗體
抗體產(chǎn)生細胞
來源
成分
特性
有效抗體含量
沉淀反應
制備方法
純化方法
應用
	多株B細胞及其子代細胞
人或動物免疫血清
混合物,能識別多種抗原決定簇
特異性和親和性批次間不同
0.1~1.0mg/ml血清
易形成
免疫動物
硫酸銨沉淀法、親和色譜等
常規(guī)免疫學檢測
被動免疫治療和緊急預防	單株B細胞及其子代細胞
B細胞雜交瘤的小鼠腹水
均一,只識別一種抗原決定簇
高度專一性及穩(wěn)定性
0.5~5.0mg/ml（小鼠腹水）
難形成
包括兩種親本細胞的融合等
與多克隆抗體相同
用于免疫學研究與檢測
用作診斷試劑及疾病治療
?	抗體的特異性識別
   半抗原對抗體識別的影響 
   半抗原的結(jié)構(gòu)、間隔臂（或稱連接臂）的長度和結(jié)構(gòu)及其與半抗原的不同連接位點對抗體的特異性識別都有一定的影響。
   同源和異源分析 
    同源分析（homologous assay）是指用同一種半抗原制備的人工抗原與相應的抗體進行免疫分析。
    異源分析（heterologous assay）是指用同一種分析物的不同半抗原所得的抗體分別與不同半抗原所制備的包被抗原或標記抗原進行的免疫分析。 
   特異性分析 ：
    是指某種測定方法對被測物質(zhì)的專一程度，一般用抗體的交叉反應率表示。抗體的特異性取決于半抗原分子的形狀、構(gòu)象、極性和穩(wěn)定性。

半抗原對抗體識別的影響
 倍硫磷（fenthion)

不同酸性取代基對抗體特異性的影響
 
不同非解離取代基對抗體特異性的影響

不同取代基位置對抗體特異性的影響

旋光異構(gòu)體對抗體特異性的影響

抗原或抗體的標記：
直接標記
間接標記

常見免疫標記技術(shù)比較
項目	熒光免疫	酶免疫	放射免疫	金免疫	化學發(fā)光免疫
標記物
敏感性
特異性
檢測對象
所需儀器
	熒光素
中等-高
高
抗原/抗體
熒光顯微鏡
	酶
高(10pg)
高
抗原/抗體
肉眼/分光光度計	同位素
高<1pg
高
抗原
R計數(shù)儀/液閃儀	膠體金
高(50pg)
高
抗原/抗體
肉眼/電鏡	化學發(fā)光物質(zhì)
高<1pg
高
抗原/抗體
光度計/光照度計

免疫分析方法
?	根據(jù)采用的檢測手段不同，可分為：
   放射免疫分析法（Radioimmunoassay, RIA) 
   熒光免疫分析法(fluorescence immunoassay, FIA)
   酶免疫分析法(enzyme immunoassay, EIA)
   免疫層析法（immuno-chromatography assay, ICA）
   發(fā)光免疫分析法（luminescent immunoassay, LCIA）
酶免疫分析（EIA）：
酶免疫分析是利用抗原抗體反應和酶促反應的特點建立起來的方法。
?	酶免疫放大技術(shù)（EMIT）：均一
?	酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）：非均一 
                    酶標抗原直接競爭
   直接競爭抑制法 
                    酶標抗體直接競爭
   間接競爭抑制法 ：酶標抗體間接競爭

?	酶標抗體間接競爭法步驟
1.	包被（CBS，100ul/孔，包被37℃包被2h）
2.	封閉（2.0%脫脂奶粉，200ul/孔，37 ℃，0.5h）
3.	加入待測物和抗體（各50ul/孔， 37 ℃，1h）
4.	加入二抗（100ul/孔，37 ℃，2h）
5.	加入底物液（ 100ul/孔，37 ℃，15min）
6.	終止反應（2mol/L 硫酸，50ul/孔）
7.	測定（酶標儀）
       注：1~4步驟反應結(jié)束均須用PBST緩沖液洗滌。             
?	酶免疫分析技術(shù)質(zhì)量控制 
質(zhì)量控制指標：
     精密度（precision）：板內(nèi)、板間、批內(nèi)和 批間  
     靈敏度（sensitivity）：10%抑制率 
     準確度（accuracy）：回收率
     特異性（specificity）：交叉反應率  
     穩(wěn)定性（stability） 
 
           (ODmax-ODmin)-(ODx-ODmin)
抑制率I =                              ×100% 
               (ODmax-ODmin)

式中  ODmax——不加農(nóng)藥時的吸光值
      ODx——農(nóng)藥濃度為x時的吸光值
      ODmin——空白對照孔的吸光值
                      
                    目標化合物的IC50
交叉反應率%=                                ×100%
                    類似化合物的IC50
影響標準曲線建立的因素
     1）標準品：純度 
     2）反應體系中的pH和離子強度：緩沖液 
     3）反應溫度和時間 
     4）反應容量：反應液體積 
     5）反應物濃度：工作濃度 
     6）樣本或試劑貯存 
     7）酶底物系統(tǒng)

第五節(jié) 農(nóng)藥殘留其他分析方法
1 酶抑制分析測定法
酶抑制法是模擬生物的中毒機理，利用有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的毒理學原理的一種快速篩選檢測方法。 
?	酶法檢測原理
 
?	酶源選擇與提取
   動物酶源：腦酯酶液、肝酯酶液、血清酯酶
   植物酶源：面粉
?	底物與顯色劑
1.	乙酰膽堿-溴百里酚藍顯色
2.	乙酸羥基吲哚顯色法
3.	乙酸靛酯顯色法
?	酶抑制法大體分為
   肉眼觀察法（酶片法、試紙法、速測卡法）
   目視比色法（檢測箱法、試劑盒法）
   pH計測量法
   酶催化動力學光度法（速測儀法）
  肉眼觀察法（酶片法、試紙法、速測卡法） 
   原理：膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯（紅色）為乙酸和靛酚（藍色）。
      檢測范圍：0.1~10mg/kg
      分析時間：<20min
   優(yōu)點：操作簡單、成本低、速度快。
   缺點：誤差較大、人為因素較大、靈敏度較低，只能勉強定性。
目視比色法（檢測箱法、試劑盒法） 
   原理與肉眼觀察法一樣，但結(jié)果判定是根據(jù)比色管溶液的變化通過目測比色來完成。
   特點：與肉眼觀察法相比，顏色變化較明顯，但靈敏度仍然不高，誤差亦較大。
   pH計測量法
   原理：以氯化乙酰膽堿為底物，采用乙酰膽堿酯酶催化底物進行水解反應，反應程度根據(jù)產(chǎn)酸量的大小來確定，通過pH計測得pH值。
   特點：測量波動性較大，但克服了主觀判斷誤差。
酶催化動力學光度法
   原理：與目視比色法基本相同，采用分光光度計測定吸光度來判定結(jié)果。
   特點：測量準確，靈敏度較高，重現(xiàn)性好，操作簡便。

第五章 農(nóng)藥殘留分析的質(zhì)量控制

1 分析結(jié)果數(shù)理統(tǒng)計基礎(chǔ)
?	有效數(shù)字及整理規(guī)則
      有效數(shù)字                     1.05；0.45；0.35
      數(shù)字修約規(guī)則：
           四舍六入五注意，五后有數(shù)就進一；
           五后為零看左方，左為奇數(shù)則進一；
           左為偶數(shù)則舍去，左為零作偶處理；
           不論舍去多少位，都應一次修停當。
?	數(shù)據(jù)的表示
      根據(jù)工作的實際需要和可能確定數(shù)據(jù)的有效位數(shù)。如稱量標準物質(zhì)。
       數(shù)據(jù)的準確度應與試驗方法和量具的精度相匹配。如量取10.0mL溶液。
?	分析數(shù)據(jù)的取舍
      可疑值、極端值和異常值
         可疑值：與一組測定值中其余測定值明顯 
                        偏離的測定值。
      舍棄異常值的依據(jù)：2s(5%)或3s(0.3%)
      可疑值檢驗的判別準則：

2 實驗室工作條件的質(zhì)量控制
實驗室環(huán)境條件
?	殘留分析實驗室應與其他實驗室分開，并按照樣品存貯、天平稱量、樣品制備、儀器分析、高溫室、資料室等劃分功能區(qū)。
?	實驗室內(nèi)需設(shè)各種必備的安全設(shè)施，并應定期檢查，保證隨時可供使用。

試劑要求
級別	名稱	代號
特級
一級
二級
三級	基準試劑、光譜純
保證試劑、優(yōu)級純
分析試劑、分析純
化學純	S.P
G.R
A.R
C.R
?	農(nóng)藥標準品和標準溶液
    農(nóng)藥標準樣品的純度
    農(nóng)藥標準溶液的配制及使用
        名稱、純度、稱樣量、溶劑、有效期
    農(nóng)藥標準樣品及標準溶液的保存
         一般, 低溫暗處保存；
       高濃度有效期6個月；低濃度有效期3個月。
?	儀器設(shè)備的管理與檢定
    計量儀器設(shè)備應定期檢定
    儀器設(shè)備應建立檔案
    儀器設(shè)備應貼有明顯的狀態(tài)標識
    儀器設(shè)備的操作、維護人員必須經(jīng)過培訓、考核，持證上崗。
    對新采購的儀器設(shè)備，必須組織驗收。

3 分析方法的質(zhì)量評價
?	靈敏度
   是指方法對單位濃度或單位質(zhì)量的待測物質(zhì)的變化所引起的響應量變化的程度。
   最小檢出量（LOD，limit of detection )
   最低檢測濃度（LOQ，limit of quantification)
?	精密度
    是指用一特定的分析程序在受控條件下重復分析均一樣品所得測定值的一致程度。常用相對標準偏差（RSD）表示。
    平行性：是指在同一實驗室內(nèi)，當分析人員、分析設(shè)備和分析時間都相同時，用同一分析方法對同一樣品進行多份測定結(jié)果之間的符合程度。
    重復性：同一實驗室，至少有一項不同
    再現(xiàn)性：不同實驗室，同一分析方法
?	準確度
    是用一個特定的分析程序所獲得的分析結(jié)果與假定的真值之間符合程度的度量。
                    （加標試樣測定值量-空白對照量）
     回收率(%)=                                      ×100%
                               理論加標量
?	進行樣品的殘留分析時，每一批樣品測定都應做所有分析農(nóng)藥的回收率測定。
?	一般要求添加2個以上濃度，每個濃度5個平行。
?	回收率的添加量應在MRL值0.5~10倍的范圍。
回收率原則上應在70%~110%范圍內(nèi)。
?	特異性
   是指某種測定方法對被測物質(zhì)的專一程度。這一指標主要是評價免疫測定方法的。
4 農(nóng)藥殘留確證性試驗方法
?	改變色譜柱
?	改變檢測器
?	氣-質(zhì)或液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)
?	改變檢測系統(tǒng)
殘留分析方法應用實例
?	甘藍中毒死蜱殘留分析方法的建立
 
查 （理化性質(zhì)、文獻資料、MRL）
確定檢測方法 （標準曲線、最小檢出量）
確定前處理方法（提取溶劑、提取方法等）
方法準確度（添加回收率、精密度）
方法評價 
?	稱取小麥粉樣品約20g至離心管中，添加1ppm的嘧霉胺標準溶液2mL于樣品中， 在離心管中加入15mL蒸餾水，40mL乙腈（分析純），超聲波提取10min，平衡后離心5min（3500rpm），將上清液過濾至盛有4g氯化鈉的具塞量筒中，劇烈震蕩分層，靜置15min，吸取1/2上清液于平底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（50℃）濃縮近干，吹干，用乙腈（色譜純）定容2mL，倒入進樣小瓶，待測。

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